IGF-1 LR3 lyofiliserad

Att välja lämplig expressionsstam är avgörande för proteinuttryck. Vanligt använda expressionsstammar inkluderar Rosetta (DE3), BL21 (DE3), etc. Dessa stammar har effektiva T7 RNA-polymerassystem och kan effektivt uttrycka gener som drivs av T7-promotorn.
Med Rosetta (DE3) som ett exempel inkluderar dess egenskaper: innehållande T7 RNA-polymerasgenen, inducerad av IPTG-uttryck. Att bära sällsynta kodon-tRNA-gener kan effektivt uttrycka exogena gener som innehåller sällsynta kodon. Lämplig för att uttrycka toxiska proteiner eller svåruttryckta proteiner.

Betingelserna för proteinuttryck, såsom inducerarekoncentration, induktionstemperatur, induktionstid, etc., har en betydande inverkan på proteinutbyte och kvalitet. Genom att optimera expressionsförhållandena kan expressionsnivån av IGF-1 LR3 ökas.
Koncentration av induceringsmedel: IPTG är ett vanligt använt induceringsmedel, med en koncentration typiskt mellan 0,1-1 mM. Bestäm den optimala IPTG-koncentrationen genom gradientexperiment för att uppnå den högsta proteinuttrycksnivån.
Induktionstemperatur: Induktionstemperatur väljs vanligtvis mellan 16-37 grader. Lägre temperaturer (som 16-20 grader) kan bidra till att minska proteinnedbrytning och bildning av inklusionskroppar och öka utbytet av lösliga proteiner.
Induktionstid: Induktionstiden är vanligtvis mellan 2-24 timmar, och den optimala induktionstiden bestäms genom att analysera proteinuttrycksnivåer genom tidsbestämd provtagning.

Uttrycket förIGF-1 LR3 lyofiliseradupptäcktes med SDS-PAGE och Western blot-metoder.
SDS-SIDA: Samla bakterieprover före och efter induktion, utför ultraljudsfragmentering eller kemisk lysering, centrifugera för att separera supernatanten och fällningen och utför SDS-PAGE-analys separat. Genom att jämföra förändringarna i proteinband i supernatanten och fällningen före och efter induktion, bekräftades uttrycket av IGF-1 LR3.
Western blot: Använd specifika antikroppar (som anti-His-tag-antikroppar eller anti-IGF-1-antikroppar) för att utföra immunoblotanalys på SDS-PAGE-separerade proteiner för att ytterligare bekräfta uttrycket och molekylvikten för IGF-1 LR3.

Samla in de inducerade bakteriecellerna och lysera dem för att frigöra intracellulära proteiner. Vanliga sprickbildningsmetoder inkluderar ultraljudsfragmentering, högtryckshomogenisering, kemisk sprickbildning, etc. Med ultraljudsfragmentering som exempel är stegen följande:
Bakterieinsamling: Centrifugera den inducerade expressionsbakterielösningen för att samla in bakteriecellerna och återsuspendera dem i lysbuffert (som PBS eller Tris HCl-buffert).
Ultraljudsfragmentering: Bakteriesuspensionen placeras i ett isbad och krossas med en ultraljudsstörare, vanligtvis med en kort-multipel fragmenteringsmetod (som 10 sekunder varje gång, 10 sekunders intervall, upprepad 10 gånger) för att undvika proteindenaturering på grund av överhettning.
Centrifugalseparation: Centrifugera den krossade bakteriesuspensionen för att separera supernatanten och fällningen. Supernatanten innehåller lösliga proteiner, medan fällningen kan innehålla inklusionskroppar eller cellrester.

På grund av det faktum att rekombinant IGF-1 LR3 vanligtvis bär en His-tagg, kan den renas med användning av nickeljonaffinitetskromatografi (Ni NTA).
Kolonnberedning: Ladda Ni NTA-packning i kromatografikolonnen och jämvikt med jämviktsbuffert (såsom PBS innehållande 20 mM imidazol).
Provladdning: Ladda supernatanten av bakterielysat på kromatografikolonnen, så att IGF-1 LR3 med His-tagg binder med nickeljoner.
Tvätt: Tvätta kromatografikolonnen med tvättbuffert (såsom PBS innehållande 50 mM imidazol) för att avlägsna obundna eller svagt bundna föroreningsproteiner.
Eluering: Använd elueringsbuffert (såsom PBS innehållande 250 mM imidazol) för att eluera IGF-1 LR3 bundet till kromatografikolonnen och samla upp eluenten.

IGF-1 LR3-lösningen efter eluering innehåller en hög koncentration av imidazol, som måste avlägsnas genom avsaltning och koncentrationssteg för att öka proteinkoncentrationen.

Avsaltning: Använd en avsaltningskolonn eller dialyspåse för att avlägsna imidazol från eluenten och ersätt den med en lämplig buffertlösning (som PBS).
Koncentration: Koncentrera den avsaltade proteinlösningen med hjälp av ultrafiltreringsrör eller centrifugalkoncentratorer för att öka proteinkoncentrationen till önskad nivå.

Renheten och aktiviteten hos renad IGF-1 LR3 detekterades med SDS-PAGE-, HPLC- eller ELISA-metoder.
SDS-SIDA: Analysera renheten hos det renade proteinet och bekräfta att det inte finns några uppenbara föroreningsband.
HPLC: Använd omvänd fas HPLC eller storleksuteslutnings-HPLC för att ytterligare analysera renheten och molekylviktsfördelningen av proteiner.
ELISA: Enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) används för att detektera den biologiska aktiviteten av IGF-1 LR3, och dess aktivitetsnivå återspeglas av graden av bindning till specifika antikroppar.